Revista CIENCIA
Vol. (21), 3, 60-72 (2019)
DOI: http://dx.doi.org/10.24133/ciencia.v21i3.1528
Gavilanes Quizhpi (1), Aguirre Yela (1), Romero P. (1) Delgado Rodriguez (1)
(1) Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura, Centro de Nanociencia y Nanotecnología (CENCINAT).Sangolquí - Ecuador, vaaguirre@espe.edu.ec , apgavilanes@espe.edu.ec , pjromero@espe.edu.ec , vadelgado@espe.edu.ec
Recibido:noviembre, 2019 Aceptado: diciembre, 2019
RESUMEN
Este trabajo de investigación inició de la pregunta de si se produce inhibición en el crecimiento del hongo patógeno Botrytis fabae con el uso de liposomas y nanopartículas de azufre. El objetivo fue explicar cómo utilizando concentraciones 0,001 M de nanopartículas de azufre encapsulado en liposomas de fosfatidilcolina en mezclas de limoneno y octanol, actúan sobre el cultivo in vitro del hongo Botrytis fabae. Durante esta investigación se obtuvieron nanopartículas de azufre. Se demostró que la fosfatidilcolina abarcaba azufre y forma liposomas. Así mismo se identificó el hongo Botrytis fabae por el cultivo in vitro. La impregnación de los discos se realizó inmediatamente en la siembra del hongo y se detectó la inhibición completa por el componente octanol- fosfatidilcolina con nanoparticulas de azufre usados en la síntesis de los liposomas, con una sensibilidad alta de un radio de 45 mm y sin efecto por los liposomas de fosfatidilcolina con limoneno. Comparado con el tratamiento del producto comercial carbendazim, el cual formó un halo de inhibición de 17 mm de radio que corresponde a una sensibilidad intermedia. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar (DCA) y el método de sensibilidad en disco.
Palabras claves:Liposomas, Azufre, Nanopartículas, Botrytis fabae, Vicia faba, Fosfatidilcolina.
ABSTRACT
This research work initiated the question of whether inhibition in the growth of the pathogenic fungus Botrytis fabae occurs with the use of sulfur liposomes and nanoparticles. The objective was to explain how using concentrations of 0.001 M sulfur nanoparticles encapsulated in phosphatidylcholine liposomes in mixtures of limonene and octanol, act on the in vitro culture of the fungus Botrytis fabae. During this investigation sulfur nanoparticles were obtained. Phosphatidylcholine was shown to encompass sulfur and form liposomes. Likewise, the Botrytis fabae fungus was identified by in vitro culture. The impregnation of the discs was performed immediately in the seeding of the fungus and the complete inhibition by the octanol-phosphatidylcholine component was detected with sulfur nanoparticles used in the synthesis of the liposomes, with a high sensitivity of a radius of 45 mm and without effect by liposomes of phosphatidylcholine with limonene. Compared to the treatment of the commercial product carbendazim, which formed an inhibition halo of 17 mm radius corresponding to an intermediate sensitivity. A completely randomized experimental design (DCA) and disc sensitivity method were used.
Keywords:Liposomes, Sulfur, Nanoparticles, Botrytis fabae, Vicia faba, Phosphatidylcholine.
1. INTRODUCCIÓN
La planta del haba, Vicia faba, originaria de la cuenca mediterránea e introducida en el país, es importante en la alimentación de la población ecuatoriana (FAO, 2016), con impacto en la producción económica equivalente al 10 % producto interno bruto (Lucero, 2014), siendo afectada por un hongo patógeno conocido como Botrytis fabae y Botrytis cinerea, responsables de la enfermedad que provoca la pudrición de las hojas, tallos, granos y vainas (SYNGENTA, S.f) El daño a nivel de las hojas se caracteriza por unas manchas de color café rojizo también conocida como mancha chocolate (Lucero, 2014). Entre las alternativas de tratamiento que se suministra es el manejo de agroquímicos, cuyos principios activos para combatirlos son el tretracloroisoftalonitrito, dicarboxilamida y procymidone, carbendazim y benzimidazol, benomil (Peralta, 1998). La empresa Bioquirama soluciones de origen colombiana ha desarrollado pruebas de sensibilidad en disco con algunos principios activos contra Botrytis sp como el carbendazim y reporta baja sensibilidad a este principio activo (Bioquirama, S.f) En general deben ser utilizados con precaución. Para el caso de tretracloroisoftalonitrito es toxico e irritante al ser inhalado y en contacto con los ojos, tiene efectos letales para los peces y hay poca evidencia de ser teratógeno (Ecuaquimica, S.f)
Por otra parte la lecitina de soya o fosfatidilcolina es obtenida de la planta Glicyne max, muy rica en fosfatidil colina, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, utilizada en la industria alimenticia, farmacéutica (Moreno, 2018), por varias propiedades benéficas tales como su contenido en ácidos grasos omega linoleico y linolénico (Tamargo et al., 2011). Son sus fosfolípidos los que están en capacidad de dar lugar a la formación de estructuras membranosas artificiales que tienen un bicapa lipídica y en su interior moldean un compartimento acuoso idóneo para albergar principios activos. Se ha planteado como problema que el azufre es un conocido no metal que tiene propiedades antimicóticas y hay otros elementos como la plata con capacidades parecidas . Para poder utilizarlo en una escala nanométrica se lo hace reaccionar de manera que se sintetiza nanopartículas de azufre (Robles, et al., 2019), existe evidencia que el azufre es tóxico junto con alcaloides contra F. oxysporum (Argüelles, 2019) . Luego el azufre es introducido y transportado en liposomas de fosfolípidos (Berg, Stryer, & Tymoczko, 2007). La lecitina de soya en mezclas con octanol y un derivado sintético de limoneno se utilizan en la preparación, debido a que se requiere de solventes orgánicos (Lopez, s/f). Posteriormente de conocer que efectivamente existen liposomas que envuelven azufre se demuestra su efecto en un cultivo in vitro del hongo aislado de Botrytis fabae (Soria, 2015).
El objetivos general de este proyecto es determinar la acción que produce concentraciones de nanopartículas de azufre encapsulado en liposomas de fosfatidilcolina, aplicado al cultivo in vitro del hongo Botrytis fabae. Obtener las nanopartículas de azufre de tamaño y características adecuadas. Demostrar el encapsulamiento de las nanopartículas de azufre en los liposoma de fosfatidilcolina. Aislar e identificar el hongo Botrytis fabae cultivado in vitro. Constatar las consecuencias de la aplicación de los liposomas de azufre en cultivo in vitro del hongo.
2. METODOLOGÍA
2.1 Preparación de nanopartículas de azufre
En un matraz erlenmeyer se añadió un tampón formado de acetato de sodio y ácido acético a una concentración 0,001 M, utilizando 1 mL de este preparado a un pH de 4. En la solución anterior se juntó 1 mL de ácido clorhídrico al 1 %. Se agregó finalmente 23 mL de tiosulfato de sodio 0,001 M, pentahidratado. Se dejó 1 hora de tiempo para que se produzca la reacción y libere nanopartículas de azufre. La medida del pH de la mezcla mostraba un valor de 3.7.
2.2 Preparación de la muestra para la observación al microscopio electrónico TEM.
En un ependor se lo lleno con la solución de nanoparticulas de azufre preparado a partir de tiosulfato de sodio 0,001 M. En otro ependor lo llenamos de los liposomas de azufre/octanol-lecitina (S/O.L) y octanol-lecitina/azufre (O.L/S) que han sido incorporados con las nanopartículas de azufre para ser observados al microscopio electrónico de barrido TEM. En un ependor adicional lo llenamos con la solución de limoneno-lecitina de soya/ nanoparticulas de azufre (L.L/S) y S/L.L. Así se envía para que sean analizadas en TEM.
2.3 Preparación de liposomas de octanol.
Basado en el método de obtención de liposomas unilaminares o método de REV (Ortiz, 2015), se pesó lecitina de soya comestible. Se añadió a un vaso con octanol y se disolvió, la mezcla obtenida fue transparente de color amarillento al 1,2 %. Luego en un balón contendrá la mezcla de octanol-lecitina mas solución de tiosulfato de sodio en una relación entre nanopartículas de azufre /octanol-lecitina de soya (S/O.L). En el otro balón de solución de nanoparticulas de azufre en solución acuosa se mezcla octanol – lecitina (O.L/S).
2.4 Preparación de liposomas de limoneno
Se pesó la lecitina de soya comestible, se añadió a un vaso con limoneno y se lo disolvió, la mezcla obtenida fue transparente de color amarillento al 1,2 %. Luego en un balón contuvo la mezcla de limoneno-lecitina mas solución de tiosulfato de sodio en una relación entre nanopartículas de azufre /limoneno-lecitina de soya (S/L.L). En el otro balón de solución de nanoparticulas de azufre en solución acuosa se mezcló limoneno –lecitina/azufre (L.L/S).
Las muestras de nanopartículas de azufre y liposomas se enviaron las preparaciones para que sean analizadas en TEM.
2.5 Crecimiento in vitro del hongo Botrytis fabae
Se sembró Botrytis fabae a partir de un medio de agar papa dextrosa (PDA), donde fue previamente aislado e identificado por la observación al microscopio óptico.
Al mismo tiempo del medio de cultivo de B. fabae antes mencionado se lo replico en 39 cajas Petri de PDA. En pruebas exploratorias el hongo de Botrytis fabae creció del cuarto al séptimo día de incubación.
2.6 Probar la sensibilidad del hongo frente a los liposomas
Se utilizó el método Kirby-Bauer en el que se tomó una porción de muestra del cultivo de Botrytis fabae con un hisopo y este se depositó en agua destilada, se añadió los discos impregnados con los componentes por separado que conforman los liposomas y sus mezclas inmediatamente después efectuar la siembra de Botrytis fabae. El proceso se produjo en condiciones de esterilidad. La tabla 1 siguiente expresa la interpretación necesaria.
Tabla 1. Tabla interpretativa de la prueba de sensibilidad (Técnica de Kirby Bauer).
Fuente: Rodríguez Cavallini Evelyn et al.,2005.
2.7 Diseño experimental
El método que se empleó fue el (DCA). Es una investigación explicativa, que analizo el efecto del azufre nanoencapsulado en vesículas lipídicas frente a un hongo Botrytis fabae. Las sustancias usadas en los tratamientos se describen en la tabla 3, tomando de manera constante veinte microlitros de cada uno.
Se planteó como hipótesis nula que todos los tratamientos producen inhibición del crecimiento de Botrytis fabae. El paquete estadístico utilizado fue el infostat que permitió la implementación de las pruebas de análisis de varianza y de comparaciones entre tratamientos con la prueba estadística de Duncan.
3. RESULTADOS
3.1 Síntesis de las nanopartículas de azufre tamponado
Se desarrolló la síntesis de nanopartículas de azufre utilizando el tiosulfato de sodio, con ácido clorhídrico y un tampón. Se analizaron las muestras de las preparaciones a través de DLS y TEM donde se verifico el tamaño de partícula de 11 nanómetros. Se obtuvo las imágenes de las nanopartículas de azufre, como presenta la figura 1.
Figura 1: El azufre se observa de color negro. Los diámetros de 11 nanómetros. Imagen tomada por TEMF
3.2 Síntesis de liposomas a partir de lecitina de soya y octanol con nanopartículas de azufre
El análisis TEM (Microscopía electrónica de transmisión), permito distinguir que a partir de la lecitina de soya comercial se sintetizo las estructuras artificiales de liposomas que han pasado por un proceso de sonicación y cuyo tamaño fue de 30 nanómetros incorporando nanopartículas de azufre. Se divisa como unilamelares y se notan en las imágenes de la figura 2.
Figura 2: liposoma de lecitina de soya. Se muestra estructuras esféricas de unos treinta nanómetros, característico de los liposomas
3.3 Síntesis de liposomas a partir de lecitina de soya y el sintético de limoneno con nanopartículas de azufre.
Al analizar con TEM la imagen presento estructuras esféricas constituidas por lecitina de soya utilizando el sintético de limoneno como disolvente. Los tamaños oscilan entre 17 a 30 nanómetros que es captado en las imágenes de la figura 3.
Figura 3: Liposomas de lecitina de soya. Esta imagen muestra a una estructura esférica.
3.4 Análisis del tamaño de las estructuras de liposomas de lecitina de soya con octanol y sintético de limoneno usando DLS (Dispersión de luz dinámica).
El histograma presento un tamaño promedios de 16,2 nanómetros. El histograma se elaboró en función del estudio de dieciséis imágenes seleccionadas y sus resultados son expuestos en la figura 4.
Figura 4: a) Histograma por DLS de liposomas donde se observan los siguientes resultados: el promedio de los SO-L: 4,4nm std de los SO-L: 1,4nm; liposoma 2: promedio=17,9nm, std=3,9n; liposoma 3: promedio=15,0nm, std=3,6nm. b) Histograma de liposomas donde se observa: liposoma 2+3: promedio=16,2nm, std=3,9nm
3.5 Crecimiento in vitro del hongo Botrytis fabae.
A los siete días luego de la siembra de Botrytis fabae se produjo un notable desarrollo del hongo. La colonia macroscópica es miceliar blanquecina hacia el exterior y negruzca hacia el interior. Son colonias inicialmente de color café claro y con el tiempo se vuelven parduzcas. La observación al microscopio óptico de una muestra del cultivo permitió diferenciar las estructuras típicas de Botrytis fabae donde se observa el micelio, los conidióforos y conidias y se pudo evidenciar en la imagen de la figura 5 y 6.
Figura 5: Crecimiento in vitro de Botrytis fabae en medio PDA
Figura 6: Botrytis fabae observado con 40x donde se identifica el micelio, los conidióforos y conidias.
3.6 Sensibilidad del hongo frente a los liposomas
Se realizaron ensayos de trece tratamientos y tres repeticiones utilizando los componentes que forman los liposomas por separado y sus respectivas mezclas aplicando (DCA), siendo la variable de respuesta la acción sobre el cultivo del hongo Botrytis fabae revelado en las imágenes 1, 2, 3, 4.
Figura 7: Fotografías del cultivo in vitro de Botrytis fabae. 1) Es la inhibición producida por el tratamiento cuatro de octanol donde el radio de inhibición es de 45mm de sensibilidad positiva. 2) Es el tratamiento de la mezcla octanol lecitina cuya sensibilidad es positiva con un radio de 45 mm. 3) Es el tratamiento ocho de liposomas de mezcla de octanol lecitina y 20 uL solución de azufre elemental produciendo una sensibilidad positiva de 45 mm de radio. 4) Es el tratamiento doce usando el producto carbendazim y obteniendo una sensibilidad intermedia de 17 mm de radio.
La siguiente tabla 2 arroja los datos del análisis de varianza usando el programa estadístico infostat.
Tabla 2. Análisis de la varianza de los tratamientos y respuestas en el desarrollo del cultivo in vitro de Botrytis fabae.
El p valor es 0,0001 para los tratamientos siendo menor a p – valor 0,05 por lo que se rechazó la hipótesis nula y se aceptó la hipótesis alternativa de que si existe diferencias significativas entre los tratamientos. El coeficiente de variación de 5,94% es una buena medida al ser un valor bajo y encontrarse hasta el 10% y quiere decir que en el ensayo los datos de respuesta obtenidos muestran mayor homogeneidad en los valores. Conforme al análisis de varianza los tratamientos #4 de octanol, #6 mezcla de octanol-lecitina de soya, #8 mezcla de octanol -lecitina y 20 uL solución de nanopartículas de azufre, con una respuesta de halo de 45,7 mm de radio que es prácticamente una inhibición total en crecimiento del hongo Botrytis fabae son calificados con la letra C y tienen una sensibilidad positiva. El tratamiento 12 compuesto de carbendazim con 0.0625 mg y tomando 20 uL, provoca una respuesta de sensibilidad intermedia con un radio de inhibición de 17 mm y es el que normalmente se usa como tratamiento del hongo Botrytis fabae y se lo representa con la letra B. Los tratamientos 1, 3, 2, 5, 9, 13, 11, 10, son de sensibilidad negativa como por ejemplo la solución de tiosulfato de sodio 0,001 M o el ácido clorhídrico al 1 % en los que hay ausencia de formación de halo y gran crecimiento del hongo Botrytis fabae y es representado por la letra A. Observar los resultados en las tablas 2 y 3.
Tabla 3. Resumen de la respuesta de los tratamientos y los radios de inhibición provocados en el desarrollo de Botrytis fabae.
Fuente: El autor.
Figura 8: Se observa los tratamientos los cuales han provocado una sensibilidad positiva inhibiendo el desarrollo de Botrytis fabae en las barras de color rojo. Los demás tratamientos son de sensibilidad negativa.
Nota: Los tratamientos se designan con las letras T y el número correspondiente.
4. DISCUSIÓN
El tratamiento de los liposomas sintetizados de la mezcla octanol-lecitina de soya y nanopartículas de azufre en concentración 0.001M, utilizando veinte microlitros son altamente efectivas contra el hongo Botrytis fabae debido a que en su síntesis se utiliza el octanol.
El octanol tiene el propósito de disolver la lecitina de soya y es un componente principal de la mezcla para la síntesis de los liposomas, siendo el responsable de ese efecto de impedir el desarrollo de Botrytis fabae, se deduce porque ocurre el mismo hecho cuando se utiliza 20 uL del octanol exclusivamente, cuyo nivel de aparición del radio de inhibición es idéntico para ambos tratamientos, con un valor de cuarenta y cinco milímetros. Existe una patente declarada en organización mundial de propiedad intelectual WIPO donde se indica la numero 291. (MXPA/a/2003/003648) referida a una mezcla que contiene octanol y es mencionada como formulaciones auxiliares agroquímicas para plagas (Patent Núm. PA/a/2003/003648, 2005).
Otro trabajo propone la utilización de lecitina de soya empleando el alcohol etílico como disolvente para formar liposomas vacíos (Gonzalez, 2014). En el presente estudio cuando se probó con alcohol etílico el nivel de disolución fue poco eficiente debido a que se comporta por su polaridad semejante al agua (Fernández, s/f).
En otro estudio utilizan lecitina para la formación de liposomas con el propósito de englobar el hierro II congelando y descongelando la suspensión lecitina, en nuestro método se logra la formación sin someter a congelación a la suspensión de fosfoglicérido (Haguer, 1996).
La evidencia vislumbra que los liposomas formados por el sintético de limoneno, lecitina de soya y nanopartículas de azufre en concentración 0.001M, no tienen acción inhibitoria en el crecimiento del hongo. El limoneno es un tipo de terpeno y estos terpenos son degradados por Botrytis cinerea en racimos de uva hasta compuestos que han disminuido en sus propiedades aromáticas y así avanzar en su ataque (Togores, s/f). Al ser variedades muy cercanas con Botrytis fabae podría ser la razón de nula actividad inhibitoria de su desarrollo.
La hipótesis de que al menos un tratamiento utilizando liposomas es significativo frente al crecimiento de Botrytis fabae se adopta en el trabajo. Es interesante por otra parte que el tamaño de los liposomas fluctuó entre 17 a 25 nanómetros y se los aprecia como unilaminares coincidiendo con las dimensiones propuestas en otro estudio de 25 a 50 nm cuando en la técnica se ha sometido básicamente a ultrasonicación (Lopez, s/f).
Se sintetizan las nanopartículas de azufre a partir del tiosulfato de sodio pentahidratado al valerse de un amortiguador, arrojando un tamaño promedio de 11 nanómetros. Otro trabajo logra utilizar el azufre cero, pero a partir sulfuro de hidrógeno para que sea de mayor biodisponibilidad en seres humanos (Romanillos, 2013).
La sustancia de elección para combatir al hongo Botrytis fabae el carbendazim tiene menor eficacia que la sustancia octanol cuando se lo usa aisladamente y en mezcla de la síntesis de liposomas. El radio de inhibición del carbendazim de 17 mm es inferior al de octanol y la mezcla S/O.L de 45 mm. En un estudio realizado del carbendazim frente a Botrytis cinerea en sus resultados encontraron una sensibilidad intermedia con una dosis de 100 mg/litro (Zealand, 1985).
Las sustancias como el ácido clorhídrico, el ácido acético al ser probado su efecto en el cultivo de Botrytis fabae se produce una sensibilidad negativa. Se argumenta en este sentido que el hongo crece adecuadamente en pH ácido para luego aprovechar las sustancias ácidas en su propio desarrollo y modificar el pH hasta valores superiores a 3.5. Un estudio en Botrytis cinerea plantea que crece y germina los conidios perfectamente en pH superiores a 3.7 (Martinez & Moreno, 2008).
5. CONCLUSIONES
Se pudo probar la obtención nanopartículas de azufre a partir de tiosulfato de sodio en concentración 0.001M, evidenciando su presencia por TEM (Microscopía electrónica de transmisión), con tamaños de 11 nm medidos con dispersión de luz dinámica (DLS).
Se sintetizo liposomas utilizando lecitina de soya comestible, cuyas dimensiones oscilan en promedio de 16,2 nanómetros observados por TEM, empleando dos sustancias de diferente naturaleza, siendo el octanol y un derivado sintético de limoneno, parte de sus síntesis.
Se aisló Botrytis fabae in vitro y con un DCA se aceptó la hipótesis alternativa de que si existe diferencias significativas entre los tratamientos. El coeficiente de variación fue de 5,94 %. Concluyendo que la mayor inhibición sobre el crecimiento de Botrytis fabae lo provocan los tratamientos 4, 6 y 8 de, octanol, octanol-lecitina de soya y la mezcla octanol-lecitina de soya -solución de nanopartículas de azufre que forman liposomas respectivamente. Lo sigue el tratamiento del carbendazim producto comercial con un halo de inhibición de sensibilidad intermedia.
Es notable que cuando los principios activos impregnados en los discos son aplicadas una vez que el hongo Botrytis fabae ha desarrollado hasta el día doce, la acción inhibitoria en el crecimiento es nula para todos los tratamientos
6. REFERENCIAS